Instruções aos autores de contribuições para o sibgrapi
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIENCIA E TECNOLOGIA CATARINENSE CAMPUS ARAQUARI BR 280 KM 27, CAIXA POSTAL 21, 89245-000 ARAQUARI – SC ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO DO ÓLEO ESSENCIAL DE MELALEUCA ALTERNIFOLIA SOBRE A MALASSEZIA PACHYDERMATIS Elizabeth Baggio Batisarlise Pompeo Clauas Cunha Espíndola2; Robert Lenoch2; Simone Machado Pereira2; Stelamaris Dezen2; Deolinda Maria Vieira Filha Resumo. O fungo leveduriforme Malassezia pachydermatis é um importante agente etiológico de otite em cães e gatos. Por estar associado a características como aumento de umidade no pavilhão auditivo, pode determinar quadros crônicos e de difícil tratamento. Empregam-se para o tratamento de malasseziose antifúngicos derivados azólicos. Porém, o aumento das infecções por leveduras, resistentes aos antifúngicos convencionais, tem despertando o interesse por novos fármacos com atividade antifúngica como os de origem natural. O objetivo deste experimento foi comparar a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com a docetoconazol, sobre a Malassezia pachydermatis. O procedimento consistiu no cultivo de 20 isolados clínicos de M. pachydermatis em Ágar Sabouraud Dextrose, adicionado de cloranfenicol e tween 80, e incubadas por 4 a 7 dias a 37 C
˚ . Para observar a sensibilidade da M. pachydermatis frente aos
antifúngicos foi realizado o teste de Microdiluição em Caldo, segundo adaptação do protocolo M-27A, (NCCLS). O resultado de Concentração Inibitória Mínima do cetoconazol foi de 0,062μ
(0,25 - 0,031) e da Melaleuca 0,195% (0,39 - 0,0975); enquanto que a Concentração Fungicida Mínima do cetoconazol foi 0,25μ
g/mL (0,5 - 0,062) e Melaleuca 0,39% (0,781- 0,39). Apesar de
não haver diferença estatística na análise de variância (p<0,05; Sigmastat 3.5), duas amostras de M. pachydermatis apresentaram resistência ao Cetoconazol, correspondendo a 10% do total de amostras analisadas e nenhum isolado mostrou-se resistente ao óleo de Melaleuca alternifolia.Palavras-chave: Microdiluição em Caldo. Concentração Inibitória Mínima. Concentração Fungicida Mínima. Sensibilidade Antifúngica.1. Introdução
A Malassezia pachydermatis é um importante agente etiológico de otite em cães e gatos. É
uma levedura que possui dupla membrana, forma elíptica globosa e reproduz-se por brotamento
unipolar repetitivo e não é dependente de lipídio (SCHIOTTFELDT et al., 2002). Está associada a
características como aumento de umidade no pavilhão auditivo, determinando quadros crônicos e de
difícil tratamento. Atualmente, o principal tratamento preconizado para a otite fúngica de cães e
gatos são os derivados azólicos. O uso indiscriminado destes antifúngicos pode causar infecções
Estudante de graduação Medicina Veterinária - IFC- Araquari, bolsista PIBIT CNPq
Professora IFC- Araquari, coordenadora do projeto. Email : deolinda.carneiro@ifc-araquari.edu.br
resistentes. Este fato desperta interesse pela busca de novos fármacos, e entre estes se destacam os
O gênero Melaleuca é originário da Austrália, onde é utilizado há muitos anos pelos
aborígenes no tratamento de suas doenças. Entre as espécies do gênero se destaca a Melaleuca alternifolia, pois sua composição tem menor quantidade de componentes com potencial alergênico
como o cineol e o dlimonene (KNIGHT e HAUSEN, 1994). O seu óleo pode ser extraído das
folhas, ramos e caule, e tem sua composição regulamentada pela ISO 4730 (ISO 4730, 1996). As
propriedades anti-sépticas, antimicrobianas, antifúngicas e cicatriciais do óleo essencial da
Melaleuca, aliados à sua boa capacidade de penetração e escassez de resposta alérgica, têm
apresentado ótimos resultados em estudos que avaliam seu uso no tratamento das dermatopatias em
Devido a ausência de relatos referentes a atividade antifúngica da M. alternifolia sobre
isolados clínicos de Malassezia pachydermatis, e baseando-se na aplicabilidade do óleo essencial
desta planta para o tratamento de enfermidades causadas por leveduras em humanos, desenvolveu-
se este estudo, cujo objetivo foi observar o efeito antimicrobiano, in vitro, da M. alternifolia sobre
cepas de M. pachydermatis, comparando-o ao cetoconazol. Busca-se assim, encontrar uma possível
alternativa futura para o tratamento desta freqüente enfermidade na clínica de pequenos animais. 2. Metodologia 2.1 Malassezia pachydermatis 2.1.1 Isolamento das amostras
As amostras de cerúmen foram coletadas de cães sadios e/ou com sintomas de otite por
leveduras. Foi introduzido um swab estéril no canal auditivo vertical de cada ouvido. Realizou-se
um imprint do material em uma lâmina de microscopia e corou-se com Panótico Rápido. Ao
microscópio (1000x) analisaram-se três campos distintos em cada lâmina e foi contabilizado o
número de células compatíveis com a morfologia da M. pachydermatis e aplicou-se o seguinte
score (-) negativo; (+) de uma a cinco células; (++) de seis a dez células e (+++) mais do que dez
células (NOBRE et al., 2001). Concomitantemente estas amostras foram semeadas em Ágar
Saboraud Dextrose (37˚C por 4 dias), e identificas segundo Schlottfeldt (2001) para M. pachydermatis. Fizeram-se repiques até se obter cultura pura.
2.1.2 Preparo do inóculo INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIENCIA E TECNOLOGIA CATARINENSE CAMPUS ARAQUARI BR 280 KM 27, CAIXA POSTAL 21, 89245-000 ARAQUARI – SC
Fone (47) 3803 O preparo do inóculo seguiu o protocolo descrito pelo documento M-27A, NCCLS
(NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARTS, 1997, com
adaptações. Obteu-se o inóculo final desejado de 0,5x106 a 2,5x106células/mL. 2.2 Antifúngicos 2.2.1 Cetoconazol (CET)
Dilui-se CET em HCL 0,2N obtendo-se uma solução com concentração de 16000µg/ml
2.2.2 Óleo Essencial de Melaleuca alternifolia (MA)
O óleo essencial de Melaleuca alternifolia (MA) foi gentilmente cedido pela Profa. Dra. Vera
Maria Carvalho Silva Santos, (IFC-Araquari, SC) armazenado a -20˚C e envolto em papel alumínio
2.3 Método de Microdiluição
O teste para observar a sensibilidade da M. pachydermatis frente aos antifúngicos CET e
MA foi realizado segundo o protocolo descrito pelo documento M-27A (NCCLS), adaptado por
Eichemberg (2000). Foi utilizada uma placa de microtitulação de 96 poços com fundo chato. A
placa foi organizada da seguinte forma: a coluna 1 correspondeu ao controle negativo (200μL de
SD+CT), e a coluna 12 ao controle positivo (100μL de SD+CT + 100 μL do inóculo). As linhas A e
B corresponderam às diluições de MA, linhas C e D de CET. Foram preparadas 10 diluições
duplicadas de MA e CET, com gradiente 10 vezes maior que a solução final usada da droga e do
Desta forma, as soluções obtidas tiveram a concentração de 8 a 0,015μg/mL de CET e
50 a 0,09% de MA, com uma concentração final de 0,001% (v/v) de Tween 80. As diluições foram
depositadas em poços contíguos (2 a 11) de placas de microtitulação estéreis. A solução contendo
SD+CT e cada isolado de M. pachydermatis foi transferida em alíquotas de 100μL aos poços da
placa de microtitulação, que já possuíam os 100μL da solução contendo CET ou MA.
Subsequentemente, as placas foram incubadas a 37˚C por 96 horas. Posteriormente, foram
adicionados em todos os poços 20µL de resazurina a 0,01% em solução aquosa esterilizada e após 4
h de reincubação a leitura foi realizada. 2.3.1 Obtenção da CIM
Os resultados das CIMs (Concentração Inibitória Mínima) obtidas foram submetidas à
análise descritiva dos valores de CIMs para cada antifúngico testado: a CIM50, definida como a
concentração inibitória mínima da droga capaz de inibir 50% das amostras testadas e CIM90,
definida como a concentração inibitória mínima da droga capaz de inibir o crescimento de 90% das
amostras testadas. Para interpretação dos dados as amostras de M. pachydermatis foram
classificadas em Sensível (S), Sensibilidade Intermediaria (I) e Resistente (R), de acordo com
critério proposto por Colombo et al. (1994): S=CIM-amostra≤CIM-50%; I=CIM 50 %<CIM-
amostra≤CIM-90%; R=CIM-amostra>CIM-90%. 2.3.2 Obtenção da CFM
A CFM (Concentração Fungicida Mínima) dos antifúngicos foi determinada por meio do
sub-cultivo, em Ágar Sabouraud Dextrose, de 100 µL do conteúdo dos poços onde não houve
crescimento dos fungos. A leitura foi feita após 24 horas de incubação a 37ºC e a CFM foi definida
como a menor concentração de extrato que inibiu qualquer crescimento fúngico nas sub-culturas. 3. Resultados e Discussões
A CIM e a CFM do óleo essencial de MA e CET foram observados pela técnica de
Microdiluição em Caldo frente aos 20 isolados clínicos de leveduras Malasseziapachydermatis. Os
resultados encontrados podem ser visualizados na Tabela 1. Segundo a análise de variância
(Sigmastat 3.5), não houve diferença estatística entre os dois tratamentos (p<0,05). Comprova-se
assim, que o efeito in vitro do óleo essencial desta planta é tão efetivo quanto o CET, sobre isolados
Tabela 1. CIM50, CIM90, CFM50 e CFM90 de Melaleuca alternifolia e Cetoconazol para Malassezia pachydermatis. Tratamentos M. alternifolia Cetoconazol INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIENCIA E TECNOLOGIA CATARINENSE CAMPUS ARAQUARI BR 280 KM 27, CAIXA POSTAL 21, 89245-000 ARAQUARI – SC
Os números entre ( ) correspondem ao número de amostras que apresentaram esta diluição. Medianas seguidas da mesma letra minúscula na coluna não diferiram estatisticamente entre si (p>0,05) pelo Teste de Tukey.
Nas condições do presente experimento, não houve diferença estatística significativa entre a
Concentração Inibitória Mínima (CIM) nem para a Concentração Fungicida Mínima (CFM) da MA
e do CET, demonstrando que o óleo mostrou-se tão eficaz quanto o CET. Pode-se observar na tabela
1 a sensibilidade ou resistência das amostras frente ao antifúngico testado e ao óleo de M. alternifolia. O óleo de MA e CET apresentaram idêntica atividade fungistática e semelhante
atividade fungicida nos vinte isolados. Duas amostras de M. pachydermatis apresentaram
resistência ao CET correspondendo a 10% (2/20) do total de amostras analisadas. Nenhuma amostra
A tabela 2 mostra a distribuição dos padrões de CIM, onde para MA variou entre 0,781 a
0,04875% e a CIM para o CET de 1 a 0,0155 µg/mL. Tabela 2. Concentração inibitória Mínima de Cetoconazol e Melaleuca alternifolia para 20 isolados de Malassezia pachydermatis, determinado pelo método de microdiluição em caldo. nazol(µ M. alternif olia
Não existem trabalhos que comparem a atividade antifúngica do óleo da M. alternifolia frente
cepas de M. pachydermatis. Entretanto Hammer et al (2000), observaram a sensibilidade in vitro de
diferentes espécies de Malassezia ao óleo desta planta e obtiveram os seguintes valores: M. furfur
0,12 a 0,25%; M. sympodialis 0,0016 a 0,25%; M. slooffiae; 0,12 a 0,25%; M. globosa 0,03 a
0,016% e M. obtusa 0,12% (v/v). Valores estes que se assemelham aos observados no presente
Mondello et al. (2003) também observaram atividade antifúngica deste óleo, em
experimentos invitro sobre leveduras do gênero Candida e do gênero Criptococcus, obtendo CIM
50 entre0,125 a 0,06 % e CIM 90 entre 0,25 a 0,06 %. Hammer, (2002) testou a atividade in vitro
da M. alternifolia frente à dermatófilos e outros fungos filamentosos e encontrou CIM para todos
os fungos que variou entre 0,004% e 0,25%, e CFM variou de <0,03% e 8,0%.
Os valores de CIM e CFM observados neste trabalho para o CET também assemelharam-se
aos de outros autores. Eichenberg (2003), analisou 82 amostras de M. pachydermatis isoladas de
cães, testadas quanto a susceptibilidade antifúngica pelo método de Microdiluição em Caldo. A
faixa de CIM do CET de 0,015 a 0,25µg/mL (média 0,08µg/ml). Nascente et al. (2003) avaliaram a
sensibilidade antifúngica de 24 cepas através da técnica de MC, utilizando a mesma metodologia
descrita por Eichenberg (2003), sendo que os valores de CIM encontrados foram 0,03 – 8 μg/ml
Os resultados de Concentração Inibitória Mínima e Concentração Fungicida Mínima pelo
método de microdiluição revelaram sensibilidade dos isolados de Malasssezia pachydermatis ao
Cetoconazol e ao óleo essencial de MA. Apenas duas amostras de M. pachydermatis apresentaram
resistência ao CET, correspondendo a 10% (2/20) do total de amostras analisadas e nenhum isolado
mostrou-se resistente ao óleo de MA.
As análises in vitro através da técnica de MC comprovaram que a atividade fungistática do
óleo de MA mostrou-se tão eficiente quanto à do CET, enquanto a atividade fungicida do óleo foi
melhor que a do CET, nas condições deste estudo. O CET é um antifúngico amplamente utilizado
no tratamento de otite externa em cães. Uma vez que o óleo essencial de MA demonstrou efeito
semelhante, pode-se considerar como alternativa ao tratamento de patologias causadas por
Malassezia pachydermatis. Este indicativo é reforçado pelo fato de não se haver observado
amostras de M.pachydermatis resistentes ao óleo de M. alternifolia.
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Fone (47) 3803 Para verificar a possibilidade efetiva de uso do óleo essencial de MA no tratamento de otites
por Malassezia pachydermatis é necessário observar seu efeito in vivo, através de ensaio clínico,
que possibilitará observar seu potencial como medicamento. 4. Conclusões
O óleo essencial de Melaleuca alternifolia mostrou atividade fungistática e fungicida in vitro semelhante ao cetoconazol sobre isolados clínicos de Malassezia pachydermatis.5. Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil (CNPq) pela
À Profa Dra. Vera Maria Carvalho Silva Santos, (IFC-Araquari, SC) por gentilmente ceder o
6. Referências
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Service Material from the General Service Office TRADITIONS CHECKLIST from the A.A. Grapevine These questions were originally published in the AA Grapevine in conjunction with a series on the Twelve Traditions that began in November 1969 and ran through September 1971. While they were originally intended primarily for individual use, many AA groups have since used them as a basis for w
Table 302.4_List of Hazardous Substances and Reportable Quantities [Note: All Comments/Notes Are Located at the End of This Table] ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Statutory Final RQ Hazardous substance CASRN codedagger; RCRA waste No. pounds (Kg) ------------------------------------------------------------------------